工业微生物涉及食品、制药、石油、皮革、轻化工等多种行业。通过微生物发酵途径生产抗生素、丁醇、维生素C以及一些风味食品等;某些特殊微生物酶可用于皮革脱毛、冶金、采油采矿等生产过程,甚至直接作为洗衣粉等的添加剂;通过对枯草芽孢杆菌的基因组研究,发现了一系列与抗生素及重要工业用酶相关的基因。国内维生素C两步发酵法生产过程中的关键菌株氧化葡萄糖酸杆菌的基因组研究,使我们找到与维生素C生产相关的重要代谢功能基因,经基因工程改造,实现新的工程菌株的构建,简化生产步骤,降低生产成本,实现经济效益的大幅度提升。对工业微生物开展基因组研究,不断发现新的特殊酶基因以及重要代谢过程和代谢产物相关的功能基因,并将其应用于生产以及传统工业、工艺的改造,推动现代生物技术的迅速发展。

由于微生物个体微小,种类繁多,在实际的研究过程中,存在很多困难。比如要从自然界样品中分离出某种特殊功能微生物,从多样性的基因组文库或突变文库中筛选出性能提升或产生新代谢产物的突变克隆等。传统的筛选方法大多使用人工手动挑取然后检测筛选,通量低,速度慢,易出错。

Molecular Devices作为药物筛选领域的技术领导者,为微生物的筛选推出了高通量、自动化的解决方案,大大加快微生物筛选,快速找到对人类有用的微生物,改善我们的生活,增加经济效益。Molecular Devices推出的QPix400系列微生物高效克隆筛选系统的功能和筛选流程如下图所示:

Molecular Devices高效微生物筛选技术-引领工业育种和生物能源新时代-焦点中国网

1、高效筛选技术在工业微生物菌种选育方面的应用

工业微生物主要是指能够应用于工业化生产的微生物。从自然界中获得的原始菌种通常都不适合于工业化生产。因为原始菌种的目标产物通常比较低,而且,无法适应大规模工业化培养的苛刻条件;或者需要人为提供优越条件增加生产成本。所以,作为工业生产菌种的微生物通常都是经过人工重复多次筛选过的优质微生物。

菌种选育通常需要多次重复进行,融合在整个生产过程中,需要花费大量时间和人力。QPix400高效筛选系统作为高通量自动化平台,可以在整个菌种选育过程中发挥作用,大大提高菌种选育的速度,节省时间和成本。

QPix系统筛选菌种示意图:

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通过物理化学方法或分子生物学方法获得多样性菌种库,使用QPix系统根据克隆的大小、外形、颜色、距离、荧光以及halo圈等参数对菌种库进行筛选,并挑取符合要求克隆到微孔板进行培养。根据微生物或产物的不同类型,有不同的筛选检测方法:如上图方法1所示,对于能够产生抑菌圈、水解圈或颜色圈的菌种,QPix系统可以点样品到平板,涂布检定菌制作检定板,并进行成像、识别计算菌圈大小,挑取满足参数的克隆;如方法2所示,对于不能产生菌圈的克隆,可以通过产物的显色反应,使用酶标仪等仪器进行光吸收比色法检测定量;此外,为了满足更高通量的初筛要求,如方法3所示,QPix系统可以将样品密集点到纤维素膜或琼脂板表面,制作样品阵列,通过杂交、显色或不同培养条件进行高通量初筛,大大节省时间和筛选成本。

目前,很多制药企业和生物公司已经把QPix系统作为标准的菌种筛选平台使用,如Bayer、Pfizer、Dow AgroSciences、Zymergen以及Global Bioenergies等。下图为Global Bioenergies的菌种筛选流程:QPix系统可以在菌种筛选阶段大大提高效率和通量,通过高通量初筛,减少下游检测的工作量和成本。

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2、高效筛选技术在酶工程方面的运用

酶工程是指将酶或者微生物细胞、动植物细胞、细胞器等投入反应器,利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段将相应的原料转化成有用产物的技术。它包括酶制剂的制备,酶的固定化,酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容。酶作为一种生物催化剂,已广泛地应用于食品工业、轻工业、医药工业、农业、能源开发及环境工程等方面。

酶在食品加工中的应用

酶在食品工业中最大的用途是淀粉加工,其次是乳品加工、果汁加工、食品烘烤及啤酒发酵。与之有关的各种酶如淀粉酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、凝乳酶、蛋白酶等占酶制剂市场的一半以上。

酶在轻工业中的应用

酶工程在轻工业中的用途主要包括:洗涤剂制造(增强去垢能力)、毛皮工业、明胶制造、胶原纤维制造(粘接剂)、牙膏和化妆品的生产、造纸、感光材料生产、废水废物处理和饲料加工等。

酶在能源开发方面的应用

在全世界开发新型能源的大趋势下,利用微生物或酶工程技术从生物体中生产燃料也是人们正在探寻的一条新路。例如,利用植物、农作物、林业产物废物中的纤维素、半纤维素、木质素、淀粉等原料,制造氢、甲烷等气体燃料以及乙醇、甲醇、异辛烷等液体燃料。

酶在环境工程方面的应用

环境净化尤其是工业废水和生活污水的净化,对人类的可持续发展具有十分重要的意义。在现有的废水净化方法中,生物净化常常是成本最低而最可行的。微生物的新陈代谢过程,可以利用废水中的某些有机物作为所需的营养来源。因此利用微生物体中酶的作用,可以将废水中的有机物质转变成可利用的小分子物质,同时达到净化废水的目的。人们利用基因工程技术创造高效菌种,并利用固定化活微生物细胞等方法,在废水处理及环境保护工作中取得了显著的成效。

酶工程研究流程示意图:

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大体上来说,酶工程用到的酶分子主要有两个来源:一是通过宏基因组学,从各种特殊环境(土壤、热泉、盐湖、海洋、冰川等)微生物资源中发现具有新功能的酶的基因;另一种是通过分子生物学技术对现有酶分子进行定向“切割”、“剪切”以及在侧链上进行化学修饰,使酶分子性能提升,或者被赋予新的功能。

酶定向进化示意图:

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不管是从自然界中寻找新的酶分子,还是通过定向进化进行修饰和改造,都需要重复筛选大量的多样性克隆库,因为符合要求的克隆都是极其稀少的。QPix400系列高效筛选平台在这个过程可以代替人工,大大提升筛选自动化水平和通量:可以自动吸取样品并均匀涂布到琼脂平板;通过大小、外形、距离、颜色、荧光、酶水解圈等条件对克隆进行筛选,并自动化挑取克隆到孔板;可以自动化对克隆库进行高效管理,比如克隆库的复制、重排等操作。

QPix系统在酶工程领域有非常成功的应用案例,如科技明星公司杜邦通过多台QPix系统的帮助,在食品、保健、环保、化工等领域寻找活性更好的酶分子,通过科技服务生活;Korea Yakult(养乐多)和Carlsberg(嘉士伯)则通过QPix高效筛选技术筛选风味更好的乳酸菌和酿酒酵母,发酵出独特口感的新型饮料。

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3、高效筛选技术在合成生物学及生物能源方面的应用

合成生物学是二十一世纪刚刚出现的一个分支学科,近年来研究进展很快。与传统生物学通过解剖生命体以研究其内在构造的方法不同,合成生物学的研究方向完全相反,它是从最基本的要素开始一步步建立零部件。与基因工程把一个物种的基因延续、改变并转移至另一物种的作法不同,合成生物学的目的在于将“基因”连接成网络建立人工生物系统,让它们像电路一样运行完成设计人员设想的各种任务。合成生物学在未来几年有望取得迅速进展,将在很多领域具有极好的应用前景,包括疫苗生产、新药研发、生物制造、生产可持续能源、环境污染的生物治理、检测有毒化学物质的生物传感器等。其中在生物能源方面的应用,将大大缓解人类在环境污染、资源枯竭等方面面临的问题。

通过合成生物学研究生物能源流程图:

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首先,通过合成生物学方法设计和构建新功能酶或微生物,可以高效转化生物质废料为糖分子;然后,通过构建活的微生物细胞工厂,通过设计和控制糖分子代谢途径,实现从糖到生物燃料分子的转变。

QPix400系统通过高通量筛选技术每天可以设计和筛选成千上万的微生物克隆,快速找到最高效和适合于工业化放大生产的微生物菌种,帮助科学家将专门“设计”的基因信息从数字转变成特殊功能的微生物体。实现从生物质到生物能源的转变。

QPix400系统在合成生物学方面研究流程图:

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从基因组数字信息到功能性微生物的转变,需要大量的分子生物学构建操作,包括平行转化、涂布以及从每个基因变异里面挑取多样的克隆,用于测序鉴定。QPix400系统使这些成为可能,在一个平台上面可以提供高通量的接种、涂布以及克隆挑取。一旦序列验证正确,每个基因的最优克隆被转化到蛋白表达菌株。在克隆和挑取阶段使用QPix400系统可以显著缩短整个流程的时间,增加效率,避免了耗费人力易出错的人工过程。全自动的工作流程一周可以准确处理上万个克隆,而且从涂布到挑取,具有完整的数据记录追踪,大大节省成本。

全球知名生物能源公司如BP(英国石油公司)、Amyris、Solazyme等都是QPix平台的用户,而且都有成功的产品上市。Amyris通过合成生物学构建工程酵母,通过酵母发酵转变甘蔗残渣为生物柴油。目前,在巴西布罗塔斯的工厂生物柴油年产量达到4000万公升。在圣保罗,大约400辆公交车每天都在使用Amyris的生物柴油作为燃料。不同于Amyris,Solazyme公司通过筛选优化微藻,使用藻类高效转化甘蔗等非粮食作物,生产生物燃油和化工产

品。2011年,美国航空公司(United Airlines)成为首家采用藻类生物燃料实现航班飞行的航空公司,并且同意每年向Solazyme公司购买2000万加仑的藻类燃料。同年,美国海军购买了大量藻类生物柴油,用于一艘驱逐舰。

Solazyme通过QPix系统筛选微藻用于生产生物燃料和新型化工原料流程图:

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综上所述,工业微生物的应用非常广泛,和我们的日常生活息息相关,尤其工业菌种的开发是其中的重中之重,快速发现和筛选到合适的工程菌,用于工业生产,能够增加工业产品的产能,同时还降低了环境污染。Molecular Devices公司一直致力于提供先进的高通量筛选技术,加速酶制剂、食品饮料、生物能源、工业发酵等行业的发展,为提高人类健康水平,改善人类生存环境而努力。

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